Desarrollo interno frente a kits validados: ¿cuál es mejor?

Publicado: 2022-03-26

Los investigadores utilizan inmunoensayos para identificar la presencia de antígenos objetivo y cuantificar la concentración de antígenos para uso experimental. Estos ensayos deben ser exactos y precisos para infundir confianza en los datos recopilados. Los anticuerpos asociados deben demostrar una alta especificidad y afinidad de unión para garantizar la precisión de los resultados y minimizar la reactividad cruzada. A pesar del uso generalizado de anticuerpos en investigación, diagnóstico y pruebas clínicas, no existen pautas estándar para validar los anticuerpos antes de implementarlos en una aplicación.

Desafortunadamente, algunos anticuerpos producidos comercialmente no han recibido la validación adecuada. Sin la validación adecuada, los investigadores pueden recibir resultados inconsistentes y generar datos sesgados susceptibles de mala interpretación. Por esta razón, es importante que los investigadores sean conscientes de los riesgos inherentes que implica el uso de kits de empresas no probadas.

¿Cómo se validan los anticuerpos en los inmunoensayos?

La validación de anticuerpos en un inmunoensayo se realiza a través de un análisis multiparamétrico de especificidad de unión, especificidad de unión en la aplicación, afinidad de unión y reproducibilidad.

  • Especificidad de unión

La especificidad de unión se refiere a la capacidad de un anticuerpo para diferenciar entre antígenos y unirse al antígeno objetivo mientras ignora a los demás. Un anticuerpo puede ser sensible a una proteína de interés y, sin embargo, reaccionar de forma cruzada con otras proteínas presentes en la muestra. Primero, es clave comprender qué tipo de inmunógenos se usaron para crear un anticuerpo y cómo se estructuran las proteínas diana en la muestra. Por ejemplo, los anticuerpos generados contra péptidos sintéticos pueden no unirse a proteínas nativas, mientras que los anticuerpos generados contra proteínas purificadas pueden no unirse cuando se desnaturalizan.

La especificidad de la unión se puede determinar mediante el uso correcto de los controles. La validación solo con controles positivos no garantiza la fiabilidad de la unión porque varias proteínas pueden tener epítopos similares o un anticuerpo puede tener múltiples epítopos. El uso de proteínas estrechamente relacionadas como controles negativos puede ser útil, pero los anticuerpos policlonales son propensos a cambiar la unión del epítopo entre lotes. Por lo tanto, ni los controles positivos ni los negativos son suficientes por sí solos y deben usarse juntos. El mejor tipo de control positivo son las células sin expresión transfectadas con la proteína de interés. El mejor tipo de controles negativos son las células knockout, que no expresan proteínas de interés.

  • Especificidad vinculante en la aplicación

Después de probar que un anticuerpo es altamente específico, el siguiente paso es asegurarse de que sea específico cuando se usa con la aplicación prevista. Las diferentes plataformas de inmunoensayo presentan diferentes estructuras de superficie, por lo que la plataforma elegida puede afectar los resultados del ensayo. Algunos ensayos comerciales muestran una alta especificidad de unión para un tipo de aplicación, pero no para otros.

La inmunoprecipitación permite a los investigadores precipitar un antígeno proteico de una solución mediante el uso de un anticuerpo que se une a una proteína. Mientras tanto, la espectrometría de masas (MS) es una técnica altamente sensible para identificar y cuantificar proteínas en muestras grandes, particularmente anticuerpos basados ​​en modificaciones de aminoácidos.

Actualmente existen dos métodos basados ​​en MS para evaluar anticuerpos. El primero consiste en calificar la calidad de los anticuerpos IP mediante la generación de anticuerpos contra otras proteínas y el uso de MS en los precipitados resultantes para cuantificar los anticuerpos que reducen sus objetivos. El segundo método implica el uso de cromatografía de exclusión por tamaño para fraccionar proteínas celulares, biotinilarlas e inmunoprecipitarlas con cada tipo correlacionado con diferentes colores de perlas, luego pasar las perlas en un citómetro de flujo para identificar el anticuerpo por color y la cantidad de proteína unida por la estreptavidina. señal.

  • Afinidad de unión

La afinidad de unión se refiere a la fuerza con la que un anticuerpo se une al epítopo objetivo. Es posible determinar la afinidad de unión de los anticuerpos monoclonales con gran precisión porque estos anticuerpos son homogéneos y selectivos para un isótopo individual. Sin embargo, solo se puede obtener una afinidad media por los anticuerpos policlonales debido a la mezcla de anticuerpos presentes. Existen varios métodos para determinar la afinidad de los anticuerpos, incluidos los métodos basados ​​en ELISA, la termoforesis a microescala (MST) y la resonancia de plasmones superficiales (SPR).

  • Los métodos basados ​​en ELISA son los más populares e implican la incubación de una concentración de anticuerpos con antígeno en una solución hasta que alcanza una etapa constante. Los kits ELISA permiten a los investigadores medir la concentración de anticuerpos no unidos.
  • MST mide cómo se mueven las moléculas a lo largo de gradientes de temperatura microscópicos mediante el uso de un láser infrarrojo y fluorescencia. Cuando se apunta con el láser IR, la unión molecular conduce a un movimiento alterado a través del gradiente.
  • SPR detecta interacciones moleculares con un detector óptico. En este método, la luz de una superficie recubierta de metal se refleja entre un anticuerpo inmovilizado en un prisma de vidrio y un antígeno en solución, y luego los investigadores analizan cómo cambia el ángulo de reflexión para determinar si se ha producido la unión.
  • Reproducibilidad de anticuerpos

El uso del mismo anticuerpo en diferentes lotes debería producir resultados similares. La reproducibilidad es vital para todas las aplicaciones, pero los investigadores han descubierto que cuando se utilizan kits de inmunoensayo listos para usar, pedir varios conjuntos de anticuerpos de la misma empresa no siempre da como resultado los mismos resultados. Esto es especialmente relevante para los anticuerpos policlonales, ya que los proveedores suelen utilizar el mismo número de catálogo para clasificar diferentes anticuerpos.

Elija kits validados de una empresa confiable

Diseñar y validar inmunoensayos internamente involucra múltiples factores, lo que hace que este sea un proceso costoso, desafiante y lento. Los inmunoensayos comerciales listos para usar pueden requerir menos mano de obra y ser más rentables para los investigadores. Sin embargo, los productos del fabricante promedio ofrecen diversos grados de validación y es posible que no brinden los mismos resultados en múltiples aplicaciones.

En última instancia, la mejor solución para muchos investigadores es trabajar con una empresa experimentada y confiable que ofrezca la opción de personalizar sus kits utilizando los reactivos existentes o desarrollando otros nuevos. Estas empresas permiten a los investigadores asegurarse de que el ensayo esté completamente validado, mantener el control sobre los resultados del ensayo y cumplir con los requisitos de calificación al tiempo que reducen el tiempo de desarrollo.